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Centrifugas
La Centrífuga


La centrífuga es el equipo que nos proporciona la técnica de separación basada en el movimiento de partículas por rotación y aceleración centrífuga de modo que, sometidas a altas velocidades durante cortos períodos de tiempo, permiten la sedimentación de los componentes de una solución homogénea según sus diferentes densidades.
De esta manera, dicha solución queda finalmente separada en dos fracciones, la fracción sobrenadante y la fracción sedimentada que queda depositada en el fondo del tubo de centrifugación. Extensamente empleada en los campos de la Biología, la Bioquímica o Medicina, la centrífuga es un equipamiento básico en los laboratorios de análisis para la separación y purificación de numerosas macromoléculas (proteínas, DNA, RNA, células o fracciones celulares).


[01] Fundamentos teóricos.

La fuerza centrífuga relativa (F.C.R.) es la fuerza requerida para que se produzca la separación. Las unidades de esta fuerza se expresan en número de veces el valor de la gravedad (X•g) y se calcula mediante la siguiente fórmula:

    F.C.R= 1,118 10-5•r•n2

Siendo 1,118•10-5 una constante.
r= radio de giro o la distancia horizontal (cm) desde el eje de rotación hasta el fondo del tubo.
n= velocidad de rotación expresada en revoluciones por minuto (r.p.m.).

El radio de giro es por lo tanto un factor determinante, junto con la velocidad de giro, en el cálculo de la FCR y es específica para cada rotor.

El rotor o cabezal es el dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos y pueden ser de dos tipos:

Rotor angular: Los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos con un ángulo fijo. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sitúa paralelo al eje de giro. Empleado habitualmente en la sedimentación de partículas de alta densidad como son bacterias, células o levaduras y en la separación isopícnica de macromoléculas (ácidos nucleicos, etc). La ventaja de este tipo de rotores es que normalmente permiten una sedimentación más rápida de las sustancias y, puesto que todos sus componentes son fijos, el riesgo de fallos mecánicos se reduce.

Rotor oscilante: Los tubos se colocan en un dispositivo (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en disposición perpendicular al eje de giro. Así, los tubos siempre  giran situados perpendicularmente al eje de giro. Su uso  se centra básicamente en la separación de partículas por gradiente de densidad y proporciona una gran versatilidad dado el posible empleo de muy diversos tamaños de tubo en un mismo cabezal.

[02] Técnicas de centrifugación.


-Centrifugación diferencial.

Es la técnica de centrifugación más común y se utiliza sobre todo para la sedimentación de células, precipitados y para la purificación parcial de fracciones celulares. La separación de partículas se basa en sus diferentes tamaños y/o densidades. En condiciones suaves de centrifugación, las partículas más grandes o más densas se precipitan. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación se centrifuga nuevamente en condiciones de mayor tiempo y F.C.R., las partículas más densas sedimentan nuevamente. Así, mediante la aplicación al sobrenadante de condiciones crecientes de centrifugación, vamos separando los distintos componentes de la muestra inicial.

-Centrifugación en gradiente de densidad.

Es un método más complejo que el anterior y permite no sólo la separación de varios o incluso todos los componentes de una muestra sino también determinaciones analíticas.
La muestra se coloca sobre una base líquida (solución de sacarosa, cloruro de cesio, Ficoll, Percoll) cuya densidad aumenta desde la parte superior a la parte inferior. Durante la centrifugación, cada componente se mueve hasta llegar a una posición en la que su densidad es la misma que la del líquido que le rodea y se detiene. De esa manera, cuando termina la centrifugación aparecen diferenciadas una serie de bandas de las cuales las más cercanas a la base del tubo contienen las partículas más densas.

La clasificación y selección del tipo de centrífuga viene dada por el valor de la F.C.R. (Fuerza Centrífuga Relativa), específico para cada una de ellas a una velocidad de giro determinada, de modo que es necesario conocer el valor de la F.C.R. que debe ser aplicado a cada muestra para elegir el tipo de centrífuga más adecuado.

[03] Tipos de centrífugas

a. Centrífugas de baja velocidad. Son de tamaño pequeño y sin refrigeración. Alcanzan una velocidad máxima de 6.000 r.p.m. Se utilizan para la separación de partículas grandes como células o precipitados de sales insolubles.

Existe una variente de éstas llamadas centrífugas microfuge o bifuge que permite llegar a velocidades de hasta 13.000 r.p.m., siendo los volúmenes de trabajo muy pequeños (microtubos) y pudiendo ser refrigeradas o no. Son útiles en el campo de la biología molecular.

b. Centrífugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades máximas entre 18.000 y 25.000 r.p.m. Son refrigeradas y normalmente disponen de un sistema de vacío para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Son útiles para la separación de fracciones celulares, pero insuficientes para la separación de ribosomas, virus o macromoléculas en general.


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